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細胞生長的檢查方法(一)

更新時間:2015-06-23      點擊次數:1974

1.直接計數法

是zui簡單的檢測細胞生長的方法。計數細胞一般利用臺盼藍(錐蟲藍染色,臺盼藍(錐蟲藍)不能透過活細胞正常完整的細胞膜,故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高,可使染料進入細胞內而使細胞著色。因此,鏡下未染色細胞認為是活細胞,而染色細胞認為是死亡細胞。

經典的細胞計數常用到血細胞計數板。細胞消化成單個細胞后,將細胞懸液加入血蓋片和計數板之間的空隙中,通常我們計數計數板的四角大方格(每個大方格又分16個小方格)內的細胞數。計完數后,需換算出每ml懸液中的細胞數。由于計數板中每一方格的面積為0. 01cm2,高為0. 01cm,這樣它的體積為0. 0001cm3,即0.1mm3。由于1ml=1000mm3,所以每一大方格內細胞數×10 000=細胞數/ml,可按下式計算:細胞懸液細胞數/ml=4個大格細胞總數/4×10000。如計數前己稀釋,可再乘稀釋倍數。計數細胞后,可以根據細胞計數結果,以細胞數為縱坐標,以天數為橫坐標繪制生長曲線。

目前也有多家公司生產自動細胞計數儀,如lifetechnology、Bio-rad等公司。自動計數儀將圖像輸入電腦后自動計數,消除了手動細胞計數的主觀性,消除了用戶之間的差異性,可以快速準確地計數細胞,并同時檢測細胞存活率及平均大小。隨著技術的不斷進步,有公司也推出了直接計數細胞的分析儀器,如Roche旗下Innovatis公司的CASY系列細胞計數分析系統,CASY細胞計數儀采用*的電脈沖三維掃描分析技術。它突破了傳統二維細胞成像分析技術和染色法的局限,提供更加的細胞計數和分析功能。無需購買染色劑,即可、快速地定量細胞濃度、體積、成團和碎片。它根據測量的體積來計算細胞成團,即使是嚴重成團的細胞,它也能正確定量。細胞死亡時,細胞膜會破損,CASY測得的是細胞核的體積,根據體積大小的差別,我們可以區分活細胞、死細胞以及細胞碎片。

2.檢測DNA合成

檢測DNA合成是目前檢測細胞增殖zui準確可靠的方法,目前常用的方法有如下幾種:

(1)3H-胸腺嘧啶核苷滲入法(3H-TdR):胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA合成的前體物,處于S期的細胞不斷地攝取TdR用以合成DNA。3H-TdR摻入法是將被放射性標記的3H-TdR摻入DNA合成期的細胞,細胞內3H-TdR摻入量的多少可客觀反映細胞復制DNA能力的大小,從而問接了解細胞增殖情況。通過檢測。H放射活性即可反映DNA含量。

1976年Mattem等首先采用此方法做體外藥敏試驗。此后經過長期的廣泛研究,也己證實該法對各種動物腫瘤及人類腫瘤均有較好的預測價值和重復性,主要用于細胞增殖的檢測與藥物敏感性試驗等。但這種方法操作復雜,試劑含有同位素,具有放射性,對實驗者有一定的危害,故限制了它的應用。

(2)BrdU檢測法:BrdU中文全名為5-溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)摻入,而后利用抗BrdU的抗體耦聯不同的酶,加入不同發光特性的底物,然后再通過比色法、化學發光檢測或熒光信號檢測底物強度等步驟,反映BrdU的摻入量。該方法不需要再和放射性物質打交道。

(3)EdU檢測法:BrdU雖然解決了接觸同位素的問題,但該方法需要變性DNA后才能與抗體結合,但這就破壞了DNA雙鏈結構,對某些后續或同時進行的試驗,如其他染料的結合染色有影響。現在有一種新的檢測方法能避免這種情況的發生——EdU檢測。EdU(5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷)也是一種胸腺嘧啶核苷類似物,但其連有的炔羥基團在天然化合物中很少見,在細胞增殖時能夠插入正在復制的DNA分子中,基于EdU與染料的共軛反應可以進行快速的細胞增殖檢測分析,可以有效地檢測處于S期的細胞百分數。與傳統的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法相比,更簡單,更快速,更準確。

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